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所有推薦的檢測(cè) - 捕獲抗體對(duì)都能以相同效率識(shí)別 BNP 前體（圖中未展示）。然而，重要的是要注意，市售 BNP 檢測(cè)試劑對(duì) proBNP 的識(shí)別能力存在 18 - 20 倍的差異，因此，所有推薦的組合都已在一組 11 例 HF（心力衰竭）患者的血漿樣本中進(jìn)行了測(cè)試，以確保檢測(cè)對(duì) proBNP 具有同等識(shí)別能力。這一點(diǎn)在使用不同檢測(cè)平臺(tái)時(shí)尤為重要，因?yàn)樾枰x擇在給定條件和平臺(tái)下能最佳發(fā)揮作用的抗體對(duì)。
對(duì)于 BNP 免疫檢測(cè)，我們建議使用重組糖基化 proBNP（C 端 + N 端 GBPs，見第 8 節(jié)）作為標(biāo)準(zhǔn)品，因?yàn)檠褐?span> BNP 的前體主要以糖基化 proBNP 的形式存在。
校準(zhǔn)曲線：所有推薦的 BNP 免疫檢測(cè)都能識(shí)別三種具有相同效率的 BNP 前體多肽：合成 BNP、重組非糖基化 proBNP 和重組糖基化 proBNP。圖 5 展示了 9M1 - 24C5（A）和 5T4 - 12（B）兩種基于抗體的免疫檢測(cè)的代表性校準(zhǔn)曲線。我們之前已詳細(xì)描述過 9M1 - 24C5 免疫檢測(cè)，并在內(nèi)部測(cè)試中證明了其分析靈敏度（使用合成 BNP 作為校準(zhǔn)品時(shí)）優(yōu)于 0.05 pg/ml（圖 7D）。其他抗體對(duì)的分析靈敏度也列于下文的識(shí)別部分。
BNP 表位與市售 BNP 檢測(cè)試劑的表位具有良好的相關(guān)性：為了確定推薦的 BNP 免疫檢測(cè)所識(shí)別的表位是否與市售檢測(cè)試劑識(shí)別的表位相似，我們比較了兩種市售檢測(cè)試劑（Alforti STAT BNP 檢測(cè)試劑，表位為 36 - 24 和 5 - 13；Siemens 檢測(cè)試劑，表位為 26 - 12 和 12 - 2）以及我們的 9M1 - 2429 檢測(cè)試劑（分別針對(duì) 26 - 12 和 12 - 2 表位）的識(shí)別情況。具有相同表位特異性的檢測(cè)試劑的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好。用 BNP 免疫檢測(cè)（9M1 - 2429）獲得的檢測(cè)結(jié)果與 Alforti STAT BNP 檢測(cè)試劑（圖 6A）和 Siemens BNP 檢測(cè)試劑（圖 6B）的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好。使用針對(duì) 26 - 12 和 12 - 2 表位的檢測(cè)試劑獲得的結(jié)果與針對(duì) 37 - 24 和 14 - 21 表位的 Siemens 檢測(cè)試劑（圖 6B）的結(jié)果相關(guān)性良好。我們的一種檢測(cè)試劑（5M1 - 130）與 Siemens 檢測(cè)試劑（r = 0.97）也顯示出良好的相關(guān)性。
每種檢測(cè)試劑都使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)。市售檢測(cè)試劑的表位特異性可在 IFCC 網(wǎng)站上查詢。
腦啡肽酶抑制及其對(duì)BNP免疫檢測(cè)的影響
通過阻止內(nèi)源性BNP的降解來增加其水平，被認(rèn)為是心力衰竭（HF）治療的一種潛在策略。最近，一種名為Entresto®（“諾欣妥"，譯者注 ）的藥物已獲批準(zhǔn)用于HF治療。該藥物的活性成分之一是腦啡肽酶抑制劑，有觀點(diǎn)認(rèn)為，給HF患者使用這種抑制劑，會(huì)使BNP前體肽（proBNP）相關(guān)分子的水平升高 。
市售BNP檢測(cè)試劑的設(shè)計(jì)通常基于識(shí)別兩種表位的抗體對(duì)，至少其中一種表位針對(duì)BNP分子的C端結(jié)構(gòu)，另一種表位針對(duì)BNP環(huán)結(jié)構(gòu)（見圖2中的17 - 118序列）。鑒于腦啡肽酶切割位點(diǎn)位于環(huán)結(jié)構(gòu)，合理推測(cè)識(shí)別環(huán)結(jié)構(gòu)表位的免疫檢測(cè)抗體，在腦啡肽酶改變proBNP的情況下，可能會(huì)受到影響。然而，HF患者中proBNP的復(fù)雜多樣性，以及心臟分泌的proBNP活性形式的多樣性，意味著這個(gè)問題沒有簡(jiǎn)單答案。
我們研究了腦啡肽酶活性對(duì)多種BNP免疫檢測(cè)的影響，方法是將proBNP暴露于腦啡肽酶。令人驚訝的是，proBNP對(duì)腦啡肽酶具有抗性。3C4 - 3G12對(duì)腦啡肽酶的抗性似乎是由于腦啡肽酶切割表位的抗性。而捕獲抗體識(shí)別環(huán)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)試劑，如5T4 - 12，確實(shí)會(huì)因腦啡肽酶切割而受影響，這與預(yù)期一致 。我們發(fā)現(xiàn)5T4 - 12對(duì)腦啡肽酶切割敏感，而5T4 - 32也對(duì)腦啡肽酶作用有抗性（數(shù)據(jù)未展示）。
我們還發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)過處理的proBNP（它是BNP免疫檢測(cè)中主要的待測(cè)分子形式）實(shí)際上不會(huì)被腦啡肽酶切割，因此，僅設(shè)計(jì)用于檢測(cè)BNP的試劑，不會(huì)受到此類藥物（指腦啡肽酶抑制劑類藥物 ）的影響 。
NT - proBNP檢測(cè)試劑的研發(fā)
NT - proBNP是proBNP的N端部分，包含76個(gè)氨基酸，有7個(gè)糖基化位點(diǎn)。已發(fā)現(xiàn)NT - proBNP的生物活性僅為BNP的1/1000，這在一定程度上意味著，在臨床樣本中，NT - proBNP更穩(wěn)定。計(jì)算得出的NT - proBNP等電點(diǎn)為8.45，分子質(zhì)量為8.54 kDa。但由于糖基化，其表觀分子質(zhì)量更高 。
糖基化對(duì)NT - proBNP檢測(cè)的影響
我們的研究表明，NT - proBNP的糖基化會(huì)對(duì)某些抗體的識(shí)別產(chǎn)生負(fù)面影響。NT - proBNP分子的中央?yún)^(qū)域（如28 - 56位）因去糖基化而容易被抗體識(shí)別，而13 - 27位和61 - 76位區(qū)域的糖基化則已被充分認(rèn)識(shí) 。
為了減少糖基化對(duì)NT - proBNP測(cè)量的影響，我們使用了來自8例HF患者的樣本，這些樣本在去糖基化前后，分別用兩種檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)：一種檢測(cè)試劑的抗體對(duì)針對(duì)無 糖基化位點(diǎn)（15C4 - 13G12），另一種檢測(cè)試劑的抗體對(duì)針對(duì)糖基化位點(diǎn)（11D1 - 13G12）。圖7顯示，去糖基化對(duì)后一種檢測(cè)試劑的檢測(cè)結(jié)果有顯著影響。
在檢測(cè)NT - proBNP時(shí)，糖基化及其對(duì)檢測(cè)的影響應(yīng)在檢測(cè)試劑研發(fā)過程中予以考慮。建議選擇對(duì)糖基化不太敏感的抗體 。
圖7 糖基化對(duì)NT - proBNP檢測(cè)有不同程度的影響
使用兩種不同的免疫檢測(cè)方法（A為Alforti NT - proBNP檢測(cè)試劑，識(shí)別無 糖基化表位；B為針對(duì)糖基化表位的檢測(cè)試劑 ），對(duì)8例HF患者樣本在去糖基化前后的樣本進(jìn)行檢測(cè)。兩種檢測(cè)試劑在檢測(cè)天然（糖基化）形式（黑色圓點(diǎn)）和去糖基化形式（紅色圓點(diǎn)）的NT - proBNP時(shí)，結(jié)果差異顯著。在A檢測(cè)試劑中，去糖基化幾乎不影響檢測(cè)；而在B檢測(cè)試劑中，去糖基化會(huì)使檢測(cè)信號(hào)大幅改變 。
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