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Avivasysbio  ELISA 常見問題

你能推薦我的樣品稀釋嗎？

我可以使用該套件多少次？

我懷疑我的樣本可能含有干擾因素（溶血/脂血/血液等）。這將如何影響檢測？

為什么標準瓶中的顆粒大小不同？

我應(yīng)該如何裂解我的細胞/組織？

我需要多少樣品？

我的樣品測量值隨著進一步稀釋而增加？

我的樣品測量值低于空白？

我的空白很高，我的標準很低？

我可以使用血液樣本嗎？

Kit 可以分開運行嗎？

低標準曲線低于空白或空白太高

為什么這個試劑盒不能檢測我購買的另一種市售重組蛋白？

競爭性檢測：0 (ng/mL) 孔與空白孔

ELISA 計算說明

我應(yīng)該使用多少個細胞來制備細胞裂解物樣本？

抗凝劑（又名，“檸檬酸鹽對我的檢測有用嗎？”）

檢測 xxx（血漿、血清等）中外泌體上的跨膜蛋白。是否需要提取蛋白質(zhì)？

樣品類型的長期儲存：

標準曲線+空白有效，樣品類型為陰性。

1. 你能推薦我的樣品稀釋嗎？

由于不同用戶和樣品類型的蛋白質(zhì)表達水平范圍很大，我們不建議針對每種應(yīng)用進行特定稀釋。

我們建議始終使用試劑盒中定的稀釋劑（通常是樣品稀釋劑或標準稀釋劑）以至少 1:2 的比例稀釋。

*佳稀釋度是樣品信號強度落在動態(tài)范圍中間的位置，應(yīng)由以下任一決定：

在執(zhí)行完整實驗之前，測試您的隊列中連續(xù)稀釋的代表性樣本?；蛘?，如果樣本量有限，也可以使用相同的方法使用由幾個樣本組成的小池。

-或者-

有關(guān)預(yù)期濃度，請參閱已發(fā)表的文獻，并根據(jù)試劑盒的預(yù)期動態(tài)范圍得出*佳稀釋水平。

2. 我可以使用該套件多少次？

該板是 12 x 8 孔條。將未使用的條帶放回鋁箔袋中。

兩次運行有兩個標準樣品瓶。不要儲存重構(gòu)的標準供以后使用。

只準備立即運行所需的檢測試劑。

3. 我懷疑我的樣本可能含有干擾因素（溶血/脂血/血液等）。這將如何影響檢測？

干擾因素會影響試劑盒的生物成分（捕獲/檢測抗體），并可能影響吸光度讀數(shù)。為了減輕可疑的干擾因素：

稀釋是減輕干擾因素的*佳方法。根據(jù)試劑盒的動態(tài)范圍，在目標分析物濃度允許的范圍內(nèi)，用定的試劑盒稀釋劑稀釋樣品。

在 4°C 下以 10,000 rpm 離心樣品 10 分鐘可以去除一些干擾因素。

異嗜性或動物結(jié)合抗體必須使用特定的抗干擾緩沖液處理。

4. 為什么標準瓶中的顆粒大小不一？

這是凍干的正常現(xiàn)象。顆粒可能看起來小而致密或蓬松和絮狀。這是由于在干燥過程中整個凍干室的溫度和壓力變化非常小。這不會影響標準，只要它們被*重組。

5. 我應(yīng)該如何裂解我的細胞/組織？

推薦的機械裂解方法包含在協(xié)議中。我們建議使用冷凍/解凍或超聲波進行機械裂解以裂解細胞。細胞應(yīng)在 PBS 緩沖液中裂解。

如果出現(xiàn)以下情況，化學(xué)裂解是可以接受的：

任何清潔劑、有機溶劑或還原劑的最終濃度均小于 0.01%。

您感興趣的靶標的濃度足夠高，以至于在將裂解緩沖液*稀釋至上述檢測可接受的濃度時，可以根據(jù)試劑盒的動態(tài)范圍對其進行檢測。

在這一步，請檢查組織/細胞系的預(yù)期 RNA-seq 數(shù)據(jù)，以及蛋白質(zhì)在 Uniprot 上的細胞中表達的位置，以確保它有意義。

6. 我需要多少樣品？

試劑盒需要 100 uL，因此如果最小稀釋度為 1:2，則需要 50 uL。

7. 我的樣品測量值隨著進一步稀釋而增加？

這可能是幾個問題。通常，這是由于樣品中的干擾因素造成的。通常這發(fā)生在血清或血漿中，而不是細胞/組織/超級細胞。*佳樣品稀釋水平必須通過連續(xù)稀釋來確定。如果樣品測量值顯示從標準曲線的反向計算線性回歸的線性測量值跨越 2 或 3 次稀釋，則為*佳稀釋點。

在 ELISA 中，更多的稀釋總是更好，因為它可以減輕任何潛在的測定干擾并提供更準確的測量。

8. 我的樣品測量值低于空白？

如果樣品表達的目標分析物濃度低于測定的動態(tài)范圍，這是正常的?？瞻诇y量值更高，因為樣品中沒有任何東西，導(dǎo)致非特異性結(jié)合。在某些情況下，樣品中的少量基質(zhì)實際上會減少非特異性結(jié)合。

9.我的空白很高，我的標準很低？

這可能是一個復(fù)雜的問題，無論是用戶故障還是套件故障。

10. 我可以使用血液樣本嗎？

您可以將此試劑盒與全血一起使用，但我不推薦它。全血有很多干擾因素，可能會影響測試結(jié)果。如果您有全血，我建議將其處理成血清或血漿以獲得更好/一致的結(jié)果。

11. Kit 可以分開運行嗎？

我會推薦：

1. 在上課前準備和稀釋您的樣品。

2. 在上課前準備標準曲線稀釋液。最好在檢測前直接準備這些和樣品，但它們可能會在 30 分鐘左右就可以了。

檢測應(yīng)在制備試劑后 4 小時內(nèi)完成。檢測器和偶聯(lián)物稀釋液可以在前一步孵育期間使用前制備。

請注意，如果需要，您可以稍微調(diào)整樣品/標準孵育步驟，而不會過多地損害靈敏度。該測定將運行相同，但只會提供稍低的整體信號水平。

12. 低標準曲線低于空白或空白過高

基于觀察到低標準曲線低于空白，我懷疑這是以下一項或多項：

1. 洗孔不充分。

2. 出現(xiàn)移液錯誤。

3. 標準稀釋錯誤。

4. 試劑制備錯誤。

13. 為什么這個試劑盒不能檢測我購買的另一種市售重組蛋白？

不是所有的市售重組蛋白都能被檢測到。需要考慮重組蛋白的抗體檢測存在固有的困難。重組蛋白的折疊可能不同于內(nèi)源天然形式，并且可能阻止抗體接近表位。標記蛋白尤其如此。

標準氨基酸序列可能與您的陽性對照序列和表達系統(tǒng)不同。

即使您使用相同長度的重組蛋白，不同的表達系統(tǒng)、不同的糖基化和不同的蛋白質(zhì)折疊也會改變抗體結(jié)合。這可能就是為什么此試劑盒中的抗體無法檢測您購買的重組 NEDD9 蛋白的原因。

14. 競爭性檢測：0 (ng/mL) 孔與空白孔

對于競爭性測定，0 ng/mL 的孔可檢測抗原--復(fù)合物與試劑盒反應(yīng)的信號量，而不會與您的樣品/標準品發(fā)生競爭。由于該孔僅包含抗原--復(fù)合物，因此它與 TMB 的反應(yīng)強，因此具有最深的藍色陰影。0 ng/mL 孔的目的是讓檢測中的所有試劑和緩沖液都在沒有標準品的環(huán)境中，這樣您就可以確認您的標準品和抗原--復(fù)合物具有競爭力。

另一方面，競爭性測定的空白將是一個沒有樣品且沒有抗原--復(fù)合物的孔（手冊中的步驟 10.4），它將檢測試劑盒的非特異性結(jié)合，供您從中減去。它應(yīng)該只包含樣品稀釋劑。

15. ELISA 計算說明

可以通過幾種不同的方式通過標準曲線回歸得出樣品測量值。這真的取決于你有什么軟件。

冪指數(shù)函數(shù)或線性回歸可以正常工作，對于只有 Excel 等軟件的用戶來說通常是簡單的。如果您的標準曲線相對較直，則可能不需要 4-P（四參數(shù)邏輯 (4-PL)）。

如果曲線是 S 型曲線，如果您有一些軟件，我們總是建議進行 4-P 擬合。如果您有可以使用 4 參數(shù) S 型曲線擬合模型的軟件（例如 PRISM），這通常對許多 ELISA 用戶來說更準確，但并不是每個人都具備這種軟件功能。

16. 我應(yīng)該使用多少個細胞來制備細胞裂解物樣本？

這將取決于客戶研究的目標水平。通常以 1x108cell/ml 裂解細胞會起作用。

17. 抗凝劑（又名，“檸檬酸鹽對我的檢測有效嗎？）

對于我們的試劑盒，我們推薦肝素和 EDTA 作為抗凝劑，因為它們通常在大多數(shù)情況下產(chǎn)生更好的結(jié)果。

以下是關(guān)于用于 ELISA 樣品處理的抗凝劑的一般優(yōu)缺點列表：

抗凝物    臨    騙局

檸檬酸鹽 適用于大多數(shù)凝血測試，可保護血因子   溶解性差，抗凝作用弱。

乙二胺四乙酸 對紅細胞和白細胞的形態(tài)影響不大      對血小板聚集有影響。不適合檢測凝血和血小板功能相關(guān)實驗

肝素 抗凝能力強，不影響血細胞體積。不易發(fā)生溶血。在高溫下保持穩(wěn)定性 導(dǎo)致白細胞聚集。肝素抗凝樣品應(yīng)盡快使用，否則很快會再次凝固

如果有機會，建議使用不同的抗凝劑。

18. xxx（血漿、血清等）外泌體上跨膜蛋白的檢測。是否需要提取蛋白質(zhì)？

我們推薦以下蛋白質(zhì)提取緩沖液：

英杰華 SKU   云克隆 SKU   產(chǎn)品名稱

液晶顯示器00001  IS007-裂解緩沖液 1     裂解緩沖液：膜蛋白

液晶顯示器00002  IS007-裂解緩沖液 2     裂解緩沖液：細胞質(zhì)蛋白（結(jié)構(gòu)）

液晶顯示器00003  IS007-裂解緩沖液 3     裂解緩沖液：細胞質(zhì)蛋白（核基質(zhì)、膜）

OLCD00004   IS007-裂解緩沖液 4     裂解緩沖液：核基質(zhì)蛋白、核內(nèi)體、其他細胞器

19、樣品種類的長期保存：

樣品應(yīng)分裝在 -80oC 下。蛋白質(zhì)變質(zhì)可能/可能發(fā)生，但這*取決于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。我們的實驗室使用新鮮樣品進行驗證，但尚未進行蛋白質(zhì)穩(wěn)定性測試——如果可能，我們建議使用新鮮樣品進行檢測。

20. 標準曲線+空白工作，樣品類型為陰性。

一般來說，如果是血清/血漿，可能是由干擾（基質(zhì)效應(yīng)）引起的。如果樣品類型是細胞裂解物/組織勻漿，可能是由于使用了去污劑/化學(xué)裂解物。我們建議機械裂解是安全的。

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其他的這些是菌株

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